Химический рецептор столбнячного токсина
Работы по изучению субстанции, специфическим образом связывающей столбнячный токсин, т. е. являющейся химическим рецептором токсина, начались после того, как было показано, что мозговое вещество обладает способностью интенсивно связывать токсин. Wassermann и Takaki, установившие этот факт, исходили из теории "боковых цепей" Эрлиха, согласно которой антитела являются специфическими химическими рецепторами антигена.
Большое значение для понимания механизмов обнаруженного явления имели исследования И. И. Мечникова и его сотрудников. Они показали, что при смешивании токсина с эмульсией мозгового вещества происходит не нейтрализация токсина, как это имеет место при действии антитоксина, а лишь связывание токсина мозговой тканью. Токсин не разрушается мозговым веществом и может легко отщепляться в организме. Мозговое вещество животных, обладающих различной чувствительностью к токсину, по-разному связывает токсин: наиболее выражена эта способность у мозговой ткани морской свинки, слабо выражена у мозгового вещества курицы и почти или совершенно отсутствует у ткани мозга лягушки. Отсутствие токсиннейтрализующих свойств мозговой ткани лягушки было показано также Courmont и Doyon и в недавнее время подтверждено, Rowson.
Первая попытка выяснить химическую природу вещества, связывающего токсин, была сделана Landsteiner и Botteri. Авторы показали, что веществом, наиболее интенсивно связывающим токсин, является протагон, который получается при обработке мозговой кашицы горячим спиртом после предварительной экстракции ацетоном и затем эфиром. Связь протагона с токсином непрочна и разрушается в организме. Takaki также установил, что токсин-связывающие вещества экстрагируются из мозговой ткани горячим спиртом. Указанные авторы пришли к выводу, что наиболее эффективным токсин-связывающим веществом являются цереброзиды, особенно цереброн. Однако, поскольку в сером веществе головного мозга цереброна меньше, чем в белом, а токсин-связывающая способность первого ; больше, чем второго, было высказано предположение, что серое вещество содержит еще какой-то более активный агент.
Однако D Antona и Valensin, исследовавшие токсин-связывающую способность различных тканей, показали, что она наиболее высока у серого вещества головного мозга, причем токсин-связывающая способность последнего в отличие от других тканей мало изменяется после кипячения, но резко ослабляется после обработки эфиром.
В дальнейших исследованиях было показано, что кривая связывания токсина мозговым веществом имеет характер адсорбционной кривой; связь токсина с мозговым веществом непрочна; уже при промывке осадка физиологическим раствором часть токсина отщепляется. Связанный токсин не теряет своих токсических свойств и способности соединяться с антитоксином. Столбнячный анатоксин не препятствует связыванию токсина мозговым веществом и сам им не связывается. Последнее было показано также Pons. Однако в больших концентрациях анатоксин может предотвращать связывание токсина головным мозгом in vitro и предотвращать его летальное действие in vivo.
Новым этапом разработки проблемы явились исследования van Heyningen.
Автор подтвердил данные предыдущих авторов и показал, что фиксация токсина протагоном высоко специфична, хотя протагон связывает не только токсин, но и анатоксин. Рецептор столбнячного токсина не является цереброзидом, хотя и связан с ним. Роль рецептора играет водорастворимый ганглиозид, который находится в нервной ткани в виде водонерастворимого комплекса с цереброзидами; последними могут быть френозин, церезин, неврон. Поэтому очищенный френозин не связывает токсин и лишь неочищенный обладает этой способностью. Связываясь, токсин и ганглиозид не разрушают друг друга, так что образовавшийся комплекс может быть легко расщеплен на вещества с исходной активностью. Связывание токсина ганглиозидом весьма эффективно: токсин может связываться в количестве, почти в двадцать раз превышающем по весу количество ганглиозида. Перечисленные особенности связывания столбнячного токсина ганглиозидом отличают этот процесс от прочной инактивации других токсинов (например, дифтерийного и стафилококкового) или связывания других белков ганглиозидами, описанное другими авторами.
Степень связывания токсина ганглиозидом зависит от содержания в ганглиозиде сиаловой кислоты. По-видимому, важную роль в этом процессе играют ее свободные гидроксильные группы. При одном и том же содержании сиаловой кислоты различные ганглиозиды могут связывать разное количество токсина. Способность к фиксации токсина наиболее высока у тех из них, у которых два радикала сиаловой кислоты соединены между собой. Радикал сиаловой кислоты, связанный с галактозой, не принимает участия в фиксации токсина.
Другим фактором, определяющим степень связывания токсина ганглиозидами, является содержание в них гексозамина. Ганглиозиды из ткани неизмененного головного мозга, не содержащие гексозамина, не связывают столбнячный токсин. Однако ганглиозиды, содержащие гексозамин, но выделенные из патологически измененной мозговой ткани, не фиксируют токсин. Добавление гистона усиливает способность ганглиозида связывать токсин, добавление кальция не оказывает существенного влияния на этот процесс, хотя и токсин, и ганглиозид связывают кальций. Для оптимального связывания токсина ганглиозидом, особенно при относительно низких концентрациях токсина, важное значение имеет не абсолютное количество ганглиозидов, а соотношение между содержанием ганглиозида и цереброзида в токсин-связывающем комплексе. Возможно, что это играет роль в определении пунктов фиксации токсина в организме: токсин связывается в тех местах, в которых соотношения между ганглиозидами и цереброзидами являются оптимальными для такого связывания.
Эмульсия мозговой ткани лягушки способна связывать столбнячный токсин. Однако ее токсин-связывающая способность примерно в 2000 раз меньше, чем у мозговой ткани морской свинки. Эта особенность, как полагают указанные авторы, связана с тем, что ганглиозиды головного мозга лягушки находятся в среде с мозговой кашицей в другом физико-химическом состоянии, чем ганглиозиды теплокровных животных, они непрочно связаны с нерастворимыми в воде веществами. Выделенные же ганглиозиды связывают токсин так же, как и ганглиозиды теплокровных.
Из сказанного видно, что ганглиозиды мозгового вещества, обладающие соответствующими особенностями, могут играть роль физико-химического рецептора токсина. Выполняют ли в действительности они эту роль в организме при столбнячной интоксикации, остается пока неизвестным. Необходимы прямые данные для доказательства этого положения.
Кроме того, появились сообщения, ставящие под сомнение роль ганглиозидов как специфического рецептора токсина. North и Doery нашли, что ганглиозид образует комплекс со стафилококковым токсином, дифтерийным токсином и сывороточными белками, на основании чего авторы делают вывод о неспецифическом характере сорбции столбнячного токсина ганглиозидами. Приводятся также данные об отсутствии параллелизма между патогенным действием токсина (по величине летальной и максимальной нелетальной доз) и содержанием ганглиозида в головном мозгу животных разного возраста. Последние авторы указывают также на то, что избыток токсина не угнетает высвобождение нейраминовой кислоты из ганглиозида под влиянием нейраминидазы, хотя токсин связывается, по данным van Heyningen, нейраминовой кислотой. Тот факт, что токсин сохраняет свою токсичность после связывания ганглиозидом и что комплекс ганглиозид - токсин легко диссоциирует, также говорит, по мнению Burton и Balfour, о том, что ганглиозиды не играют роли специфического рецептора токсина.
Эти соображения, однако, не могут считаться достаточным основанием для того, чтобы отбросить представления о возможной роли ганглиозидов как рецепторов токсина в нервной системе.
В принципиальном плане следует заметить, что нет необходимости искать абсолютно специфический рецептор для столбнячного токсина. Если ганглиозид или другое вещество, могущие играть роль рецептора токсина в нервной системе, способны связывать и другие белки или более простые соединения, то из этого не следует, что сорбция столбнячного токсина этими веществами не может играть роли патогенетического механизма столбнячной интоксикации.
Тот факт, что ганглиозиды связывают не только токсин, но и анатоксин, позволяет думать, что связывание токсина осуществляется не за счет его токсической группировки. Последняя, таким образом, может оставаться свободной и оказывать свой патогенный эффект. Наличие ганглиозидов внутри тела нервных клеток, их дендритов и аксонов создает возможности для фиксации токсина и внутри клетки. Однако оказывает ли токсин свое действие внутри клетки и может ли он проникать сюда через ее мембраны, остается неясным.
Представляется возможной и следующая ситуация: если в тех или иных тканевых и даже нервных элементах существует только рецептор связывания токсина, но нет субстрата, являющегося объектом патогенного действия токсина, то связывание здесь токсина может играть роль защитного фактора. Возможно, в этом заключаются некоторые механизмы естественной, так называемой неспецифической резистентности к столбнячному токсину, и объяснение тому факту, что столбнячный токсин, введенный в некоторые отделы центральной нервной системы, не вызывает заболевания.
Brooks, Curtis, Eccles высказали в качестве одного из объяснений механизма действия токсина предположение, что столбнячный токсин может пространственно соединяться со специальными рецепторами тормозной субсинаптической зоны нейронов, в результате чего тормозной передатчик не реципируется субсинаптической мембраной и торможение не осуществляется.
В этой связи представляет интерес тот факт, что ганглиозиды связывают также и стрихнин, который также нарушает постсинаптическое гиперполяризационное торможение, причем фиксация стрихнина усиливает фиксацию токсина ганглиозидами. Ганглиозид связывает и бруцин, а также и тебаин. Оба эти вещества, как известно, оказывают действие, аналогичное стрихнину, но менее выраженное. Любопытно, что сам токсин связывает стрихнин и серотонин. Вместе с тем, как показывают исследования, ганглиозиды связывают также и морфин, серотонин, триптамин, диэтиламид лизергиновой кислоты, эрготамин и аминазин, фармакологические эффекты которых весьма различны. Правда, имеются и известные особенности в связывании этих веществ. Так, серотонин не влиял на связывание токсина ганглиозидом, и, наоборот, серотонин связывается и таким ганглиозидом, который не содержит гексозамина.
В связи с представлениями о том, что столбнячный токсин вмешивается в холинергический обмен, представляет интерес тот факт, что ганглиозид связывает ацетилхолин. Однако сам токсин на ацетилхолин не действует.
Синаптические везикулы, выделенные из нервных окончаний в мозговой ткани по сравнению с самой мозговой тканью оказываются значительно менее эффективны в отношении связывания токсина, но сами нервные окончания в два раза сильнее связывают токсин, чем исходная мозговая ткань.
Изучение токсин-связывающей способности субцеллюлярных структур нервной ткани показало, что токсин может связываться с некоторыми из этих фракций. По данным Janoff, токсин фиксируется фракциями, содержащими митохондрии, лизосомы и микросомы. Ядра и клеточный сок токсин не связывают. Zacks и Sheff также обнаружили связывание, токсина митохондриями мозга. Вместе с тем более детальное фракционирование показало, что токсин связывается синаптосомами и обрывками миелина. По-видимому, примесь последних во фракциях митохондрий, лизосом и микросом обусловливает возможность сравнительно слабого связывания ими токсина, Не исключено, что только синаптосомы связывают токсин и наличие их во фракциях миелина может имитировать способность последнего фиксировать токсин.
Данные исследований, проведенных в последнее время, заставляют ставить вопрос о возможности существования в столбнячном токсине ряда фракций, связывающихся с различными структурами и оказывающих разный эффект, или о наличии в молекуле токсина разных активных центров, действующих в разных условиях и на разные структуры.
Roux и Serre нашли, что очищенный столбнячный токсин в ацетатно-натриевом буфере оказывает влияние на парамеции, причем специфичность действия токсина доказывается тем, что его эффект снимается противостолбнячной сывороткой. В фосфатном же буфере он не действует на парамеций.
Авторы высказали предположение, что составные части токсина, действующие на парамеции и на нейроны млекопитающих, по-видимому, различны. Feigen, Peterson и соавторы пришли к выводу, что столбнячный токсин содержит фракцию, которая не связывается протагоном и оказывает не центральный, а периферический эффект, вызывая увеличение спонтанного выброса передатчика в нервно-мышечном соединении. Возможно, однако, что этот эффект обусловлен примесями к токсину.
Было высказано также предположение, что рецептором токсина в центральной нервной системе может быть субстанция Р. Оно основано на гипотезе, что субстанция Р является тормозным передатчиком, и на данных о том, что эта субстанция ослабляет судороги при столбняке и стрихнине. С этим предположением трудно согласуется тот факт, что ткань задних корешков, в которых содержится в 2 раза больше субстанции Р, чем в передних, связывает токсин так же, как и ткань передних корешков. На субстанцию Р токсин не влияет.
Из сказанного видно, что вопрос о специфическом химическом рецепторе токсина в организме требует дальнейших специальных исследований. Его выяснение, имеющее важное значение для понимания патогенеза столбняка, должно быть связано с изучением того, на какие биохимические системы и субмикроскопические структуры действует токсин.
Большое значение для понимания механизмов обнаруженного явления имели исследования И. И. Мечникова и его сотрудников. Они показали, что при смешивании токсина с эмульсией мозгового вещества происходит не нейтрализация токсина, как это имеет место при действии антитоксина, а лишь связывание токсина мозговой тканью. Токсин не разрушается мозговым веществом и может легко отщепляться в организме. Мозговое вещество животных, обладающих различной чувствительностью к токсину, по-разному связывает токсин: наиболее выражена эта способность у мозговой ткани морской свинки, слабо выражена у мозгового вещества курицы и почти или совершенно отсутствует у ткани мозга лягушки. Отсутствие токсиннейтрализующих свойств мозговой ткани лягушки было показано также Courmont и Doyon и в недавнее время подтверждено, Rowson.
Первая попытка выяснить химическую природу вещества, связывающего токсин, была сделана Landsteiner и Botteri. Авторы показали, что веществом, наиболее интенсивно связывающим токсин, является протагон, который получается при обработке мозговой кашицы горячим спиртом после предварительной экстракции ацетоном и затем эфиром. Связь протагона с токсином непрочна и разрушается в организме. Takaki также установил, что токсин-связывающие вещества экстрагируются из мозговой ткани горячим спиртом. Указанные авторы пришли к выводу, что наиболее эффективным токсин-связывающим веществом являются цереброзиды, особенно цереброн. Однако, поскольку в сером веществе головного мозга цереброна меньше, чем в белом, а токсин-связывающая способность первого ; больше, чем второго, было высказано предположение, что серое вещество содержит еще какой-то более активный агент.
Однако D Antona и Valensin, исследовавшие токсин-связывающую способность различных тканей, показали, что она наиболее высока у серого вещества головного мозга, причем токсин-связывающая способность последнего в отличие от других тканей мало изменяется после кипячения, но резко ослабляется после обработки эфиром.
В дальнейших исследованиях было показано, что кривая связывания токсина мозговым веществом имеет характер адсорбционной кривой; связь токсина с мозговым веществом непрочна; уже при промывке осадка физиологическим раствором часть токсина отщепляется. Связанный токсин не теряет своих токсических свойств и способности соединяться с антитоксином. Столбнячный анатоксин не препятствует связыванию токсина мозговым веществом и сам им не связывается. Последнее было показано также Pons. Однако в больших концентрациях анатоксин может предотвращать связывание токсина головным мозгом in vitro и предотвращать его летальное действие in vivo.
Новым этапом разработки проблемы явились исследования van Heyningen.
Автор подтвердил данные предыдущих авторов и показал, что фиксация токсина протагоном высоко специфична, хотя протагон связывает не только токсин, но и анатоксин. Рецептор столбнячного токсина не является цереброзидом, хотя и связан с ним. Роль рецептора играет водорастворимый ганглиозид, который находится в нервной ткани в виде водонерастворимого комплекса с цереброзидами; последними могут быть френозин, церезин, неврон. Поэтому очищенный френозин не связывает токсин и лишь неочищенный обладает этой способностью. Связываясь, токсин и ганглиозид не разрушают друг друга, так что образовавшийся комплекс может быть легко расщеплен на вещества с исходной активностью. Связывание токсина ганглиозидом весьма эффективно: токсин может связываться в количестве, почти в двадцать раз превышающем по весу количество ганглиозида. Перечисленные особенности связывания столбнячного токсина ганглиозидом отличают этот процесс от прочной инактивации других токсинов (например, дифтерийного и стафилококкового) или связывания других белков ганглиозидами, описанное другими авторами.
Степень связывания токсина ганглиозидом зависит от содержания в ганглиозиде сиаловой кислоты. По-видимому, важную роль в этом процессе играют ее свободные гидроксильные группы. При одном и том же содержании сиаловой кислоты различные ганглиозиды могут связывать разное количество токсина. Способность к фиксации токсина наиболее высока у тех из них, у которых два радикала сиаловой кислоты соединены между собой. Радикал сиаловой кислоты, связанный с галактозой, не принимает участия в фиксации токсина.
Другим фактором, определяющим степень связывания токсина ганглиозидами, является содержание в них гексозамина. Ганглиозиды из ткани неизмененного головного мозга, не содержащие гексозамина, не связывают столбнячный токсин. Однако ганглиозиды, содержащие гексозамин, но выделенные из патологически измененной мозговой ткани, не фиксируют токсин. Добавление гистона усиливает способность ганглиозида связывать токсин, добавление кальция не оказывает существенного влияния на этот процесс, хотя и токсин, и ганглиозид связывают кальций. Для оптимального связывания токсина ганглиозидом, особенно при относительно низких концентрациях токсина, важное значение имеет не абсолютное количество ганглиозидов, а соотношение между содержанием ганглиозида и цереброзида в токсин-связывающем комплексе. Возможно, что это играет роль в определении пунктов фиксации токсина в организме: токсин связывается в тех местах, в которых соотношения между ганглиозидами и цереброзидами являются оптимальными для такого связывания.
Эмульсия мозговой ткани лягушки способна связывать столбнячный токсин. Однако ее токсин-связывающая способность примерно в 2000 раз меньше, чем у мозговой ткани морской свинки. Эта особенность, как полагают указанные авторы, связана с тем, что ганглиозиды головного мозга лягушки находятся в среде с мозговой кашицей в другом физико-химическом состоянии, чем ганглиозиды теплокровных животных, они непрочно связаны с нерастворимыми в воде веществами. Выделенные же ганглиозиды связывают токсин так же, как и ганглиозиды теплокровных.
Из сказанного видно, что ганглиозиды мозгового вещества, обладающие соответствующими особенностями, могут играть роль физико-химического рецептора токсина. Выполняют ли в действительности они эту роль в организме при столбнячной интоксикации, остается пока неизвестным. Необходимы прямые данные для доказательства этого положения.
Кроме того, появились сообщения, ставящие под сомнение роль ганглиозидов как специфического рецептора токсина. North и Doery нашли, что ганглиозид образует комплекс со стафилококковым токсином, дифтерийным токсином и сывороточными белками, на основании чего авторы делают вывод о неспецифическом характере сорбции столбнячного токсина ганглиозидами. Приводятся также данные об отсутствии параллелизма между патогенным действием токсина (по величине летальной и максимальной нелетальной доз) и содержанием ганглиозида в головном мозгу животных разного возраста. Последние авторы указывают также на то, что избыток токсина не угнетает высвобождение нейраминовой кислоты из ганглиозида под влиянием нейраминидазы, хотя токсин связывается, по данным van Heyningen, нейраминовой кислотой. Тот факт, что токсин сохраняет свою токсичность после связывания ганглиозидом и что комплекс ганглиозид - токсин легко диссоциирует, также говорит, по мнению Burton и Balfour, о том, что ганглиозиды не играют роли специфического рецептора токсина.
Эти соображения, однако, не могут считаться достаточным основанием для того, чтобы отбросить представления о возможной роли ганглиозидов как рецепторов токсина в нервной системе.
В принципиальном плане следует заметить, что нет необходимости искать абсолютно специфический рецептор для столбнячного токсина. Если ганглиозид или другое вещество, могущие играть роль рецептора токсина в нервной системе, способны связывать и другие белки или более простые соединения, то из этого не следует, что сорбция столбнячного токсина этими веществами не может играть роли патогенетического механизма столбнячной интоксикации.
Тот факт, что ганглиозиды связывают не только токсин, но и анатоксин, позволяет думать, что связывание токсина осуществляется не за счет его токсической группировки. Последняя, таким образом, может оставаться свободной и оказывать свой патогенный эффект. Наличие ганглиозидов внутри тела нервных клеток, их дендритов и аксонов создает возможности для фиксации токсина и внутри клетки. Однако оказывает ли токсин свое действие внутри клетки и может ли он проникать сюда через ее мембраны, остается неясным.
Представляется возможной и следующая ситуация: если в тех или иных тканевых и даже нервных элементах существует только рецептор связывания токсина, но нет субстрата, являющегося объектом патогенного действия токсина, то связывание здесь токсина может играть роль защитного фактора. Возможно, в этом заключаются некоторые механизмы естественной, так называемой неспецифической резистентности к столбнячному токсину, и объяснение тому факту, что столбнячный токсин, введенный в некоторые отделы центральной нервной системы, не вызывает заболевания.
Brooks, Curtis, Eccles высказали в качестве одного из объяснений механизма действия токсина предположение, что столбнячный токсин может пространственно соединяться со специальными рецепторами тормозной субсинаптической зоны нейронов, в результате чего тормозной передатчик не реципируется субсинаптической мембраной и торможение не осуществляется.
В этой связи представляет интерес тот факт, что ганглиозиды связывают также и стрихнин, который также нарушает постсинаптическое гиперполяризационное торможение, причем фиксация стрихнина усиливает фиксацию токсина ганглиозидами. Ганглиозид связывает и бруцин, а также и тебаин. Оба эти вещества, как известно, оказывают действие, аналогичное стрихнину, но менее выраженное. Любопытно, что сам токсин связывает стрихнин и серотонин. Вместе с тем, как показывают исследования, ганглиозиды связывают также и морфин, серотонин, триптамин, диэтиламид лизергиновой кислоты, эрготамин и аминазин, фармакологические эффекты которых весьма различны. Правда, имеются и известные особенности в связывании этих веществ. Так, серотонин не влиял на связывание токсина ганглиозидом, и, наоборот, серотонин связывается и таким ганглиозидом, который не содержит гексозамина.
В связи с представлениями о том, что столбнячный токсин вмешивается в холинергический обмен, представляет интерес тот факт, что ганглиозид связывает ацетилхолин. Однако сам токсин на ацетилхолин не действует.
Синаптические везикулы, выделенные из нервных окончаний в мозговой ткани по сравнению с самой мозговой тканью оказываются значительно менее эффективны в отношении связывания токсина, но сами нервные окончания в два раза сильнее связывают токсин, чем исходная мозговая ткань.
Изучение токсин-связывающей способности субцеллюлярных структур нервной ткани показало, что токсин может связываться с некоторыми из этих фракций. По данным Janoff, токсин фиксируется фракциями, содержащими митохондрии, лизосомы и микросомы. Ядра и клеточный сок токсин не связывают. Zacks и Sheff также обнаружили связывание, токсина митохондриями мозга. Вместе с тем более детальное фракционирование показало, что токсин связывается синаптосомами и обрывками миелина. По-видимому, примесь последних во фракциях митохондрий, лизосом и микросом обусловливает возможность сравнительно слабого связывания ими токсина, Не исключено, что только синаптосомы связывают токсин и наличие их во фракциях миелина может имитировать способность последнего фиксировать токсин.
Данные исследований, проведенных в последнее время, заставляют ставить вопрос о возможности существования в столбнячном токсине ряда фракций, связывающихся с различными структурами и оказывающих разный эффект, или о наличии в молекуле токсина разных активных центров, действующих в разных условиях и на разные структуры.
Roux и Serre нашли, что очищенный столбнячный токсин в ацетатно-натриевом буфере оказывает влияние на парамеции, причем специфичность действия токсина доказывается тем, что его эффект снимается противостолбнячной сывороткой. В фосфатном же буфере он не действует на парамеций.
Авторы высказали предположение, что составные части токсина, действующие на парамеции и на нейроны млекопитающих, по-видимому, различны. Feigen, Peterson и соавторы пришли к выводу, что столбнячный токсин содержит фракцию, которая не связывается протагоном и оказывает не центральный, а периферический эффект, вызывая увеличение спонтанного выброса передатчика в нервно-мышечном соединении. Возможно, однако, что этот эффект обусловлен примесями к токсину.
Было высказано также предположение, что рецептором токсина в центральной нервной системе может быть субстанция Р. Оно основано на гипотезе, что субстанция Р является тормозным передатчиком, и на данных о том, что эта субстанция ослабляет судороги при столбняке и стрихнине. С этим предположением трудно согласуется тот факт, что ткань задних корешков, в которых содержится в 2 раза больше субстанции Р, чем в передних, связывает токсин так же, как и ткань передних корешков. На субстанцию Р токсин не влияет.
Из сказанного видно, что вопрос о специфическом химическом рецепторе токсина в организме требует дальнейших специальных исследований. Его выяснение, имеющее важное значение для понимания патогенеза столбняка, должно быть связано с изучением того, на какие биохимические системы и субмикроскопические структуры действует токсин.